為什么無動物源性?—輪狀疫苗病毒事件
摘要：輪狀病毒感染性腹瀉是嬰幼兒急診和死亡（除呼吸道感染之外）的第二位病因，目前尚無有效的治療藥物。而輪狀病毒疫苗是預防輪狀病毒感染最經濟有效的手段。在疫苗的質量控制中，外源因子是重要的檢測指標。在2010年，葛蘭素史克和默克世界兩大疫苗生產廠商所生產的 RotarixR和RotaTeqR中，均檢出有外源因子——豬圓環病毒(PCV)。這是繼腸套疊事件之后，輪狀病毒疫苗的安全性問題再度成為衛生領域關注的焦點。本次事件中所產生的焦點問題包括 PCV DNA 的來源、PCV 對人類是否致病、疫苗中是否存在完整的 PCV DNA序列和病毒樣顆粒、口服疫苗后能否造成人類的感染等安全性問題。GSK公司推測其來自于細胞傳代所用的豬源性的胰酶。在疫苗細胞基質制備中胰酶是常用的原料，這對采用細胞基質生產的疫苗的安全問題帶來了更多的困惑，同時，公認的檢測方法和標準品需要繼續完善。
近十年來，國內、歐洲、印度的重組胰島素、疫苗研發和生產、干細胞培養企業都相繼開始換用重組胰蛋白酶，我國藥典委員會也委托上海雅心生物技術有限公司開展2020年版《中國藥典》中重組胰蛋白酶標準的制定工作，上海雅心是2020版重組胰蛋白酶藥典標準制定的承辦單位，也是國家重組胰蛋白酶標準品的提供單位。重組豬胰蛋白酶是由重組大腸桿菌表達生產，氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶完全一致，具有與動物源性豬胰蛋白酶相同的酶學性質，可替代豬胰腺來源胰蛋白酶應用于各種生物技術過程中。
2010 年 3 月，Victoria 等利用宏基因組學和微生物基因組學技術，對包括口服脊髓灰質炎疫苗、 風疹病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、黃熱病病毒疫苗、水痘病毒疫苗、2種輪狀病毒疫苗及麻疹風疹流行性腮腺炎聯合疫苗在內的8種減毒活疫苗的檢測中發現，在葛蘭素史克公司（GSK）生產的輪狀病毒 （Rotavirus，RV）疫苗 Rotarix 中存在 1 型豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）的DNA片段。與此同時，FDA 于 2010年3月22日發布消息稱在Rotarix中檢出了外源性病毒成分，因此，建議暫時停止使用該疫苗。
1.輪狀病毒疫苗及豬圓環病毒
現在全球已經批準上市的輪狀病毒疫苗包括葛蘭素史克（GSK）的 Rotarix、默克 （Merck）的 RotaTeq，蘭州生物制品研究所有限責任公司生產的口服輪狀病毒減毒活疫苗（Lanzhou lamb rotavirus vaccine，LLR）僅在中國使用。3種輪狀病毒疫苗的銷售量大，使用的地區范圍廣，因此，該疫苗污染存在廣泛的社會影響和安全隱患。
PCV 是一種無包膜的單鏈環狀 DNA 病毒，呈正二十面體，直徑約 20 nm，基因組大小約為1760 nt，包括兩個主要的開放讀碼框（ORF）。PCV最早被發現于傳代豬腎細胞（PK-15）。PCV 分為 PCV1 和 PCV2 兩型，具有致病性的PCV2與目前認為無致病性的 PCV1的基因同源性僅為 76%，但基因組結構非常相似。包括人、鼠、牛、豬等多種哺乳動物體內均能檢測到 PCV 抗體，但PCV對這些動物的致病性尚未確定。
2. PCV 的檢測及應對原則
美國 FDA 采取積極措施應對該突發事件。在暫停使用 Rotarix 之后，建議美國 Merck 公司篩查其生產的輪狀病毒疫苗 RotaTeq，初步結果顯示，RotaTeq 中存在豬圓環病毒 1 型和2型的 DNA片段（疫苗液經20 倍濃縮后檢出，原液中 PCV 的DNA片段單位含量接近檢測限），該結果也得到了FDA 的證實。在收集了更多的信息并進行了內部實驗之后，2010 年 5 月 7 日，FDA 與疫苗及相關生物制品咨詢委員會（Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee）召開會議，共同研討此次污染事件。會議介紹了 PCV 意外檢出的背景情況，認為現在尚無證據證明 PCV 對人類具有致病性，并討論了 PCV 的存在對Rotarix和RotaTeq 的使用造成的風險和應對的措施。此次 PCV1 的檢出（不止是針對 PCV1）也提示現有的傳統檢測技術已不能滿足生物制品檢測的需要。對于人用病毒疫苗生產中所用的細胞介質、 病毒毒種和其他生物原料的分析檢測，現已有一些尚未應用的高級分析檢測方法，會議也對這些方法的實際應用提出了建議。2010 年 5 月 14 日，FDA 更 新了該事件的后續報道，將“暫停使用 Rotarix”的建議修改為“建議臨床重新使用 Rotarix，繼續使用 RotaTeq”。修改的依據有三點：
① GSK 和 Merck兩公司均有良好的安全記錄，并進行過大量的臨床試驗；
②尚無證據表明 PCV 可對人類安全造成危害；
③使用輪狀病毒疫苗帶來的益處遠高于PCV 存在造成理論上潛在的危害。
FDA 和廠商將繼續深入調查并評價各方檢測結果。 在中國，中國食品藥品檢定研究院（National Institutes for Food and Drug Control，NIFDC）獲悉此次事件后，及時建立和完善了 PCV 檢測技術，對注冊檢定留樣的 2 批 Rotarix 和 RotaTeq 進行了檢測，也證明了 Rotarix 中 PCV1 DNA 的存在。應 WHO邀 請，NIFDC 專家于 2011 年 5 月 18 日，赴美國馬里蘭州巴爾的摩參加了 WHO 關于生物制品中發現外源因子污染后的風險評估指導原則（草案）修訂專家會，并作了題為《我國生物制品中外源因子檢測與控制現狀》的專題報告。隨后于 5 月 19 日至 5 月 21 日，應邀參加了國際生物制品標準化協會（International Alliance for Biological Standardization，IABS）召開的關于外源因子檢測新技術和風險評估的學術研討會。
3.重組胰蛋白酶替代動物源性胰蛋白酶用于生物制藥中
近十年來，國內、歐洲、印度的重組胰島素、疫苗研發和生產、干細胞培養企業都相繼開始換用重組胰蛋白酶，我國藥典委員會也委托上海雅心生物技術有限公司開展2020年版《中國藥典》中重組胰蛋白酶標準的制定工作，上海雅心是2020版重組胰蛋白酶藥典標準制定的承辦單位，也是國家重組胰蛋白酶標準品的提供單位。重組豬胰蛋白酶是由重組大腸桿菌表達生產，氨基酸序列與豬胰腺來源的胰蛋白酶完全一致，具有與動物源性豬胰蛋白酶相同的酶學性質，可替代豬胰腺來源胰蛋白酶應用于各種生物技術過程中。
